液相色譜柱-柱效測試DEMO指南：為什么我測的柱效就是沒有COA報告高？

一、 DEMO說明

在色譜柱柱效測試時，有較多因素影響柱效測試結(jié)果，我們于此特列出各種影響及注意事項。

二、 柱效測試影響因素

1.系統(tǒng)擴散體積

定義：系統(tǒng)擴散體積影響色譜柱性能，包括進樣器到流通池的體積。 儀器系統(tǒng)擴散體積是指對色譜柱性能有很大影響，尤其是小顆粒色譜柱。

擴散體積來源組成：

圖1

儀器本身死體積具體影響：

2.1*50mm 1.6μm CORTES C18 乙腈/水=70:30（v/v）

0.4ml/min 0.5ul 丙酮，苯，二氫苊

結(jié)論：死體積增加會降低柱效、會發(fā)生額外擴散、柱效降低。小內(nèi)徑色譜柱（2.1mm）或體積較小的色譜柱受柱外體積影響，對柱效的影響更大。

案例1:

色譜柱：

Waters ACQUlTY UPLC BEH C18, 1.7 µm, 2.1 mm X 50 mm (PN 186002350）測試二氫苊

產(chǎn)品詳情請點擊：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱 186002350

附：測試系統(tǒng)擴散體積的方法：

用二通代替色譜柱，連接管路后，按照如下方法測試系統(tǒng)擴散體積。

系統(tǒng)擴散體積計算公式：

擴散體積位μL=4.4% 峰高處的三次平均峰寬（min）×流速（mL/min）×1000

計算示例：

2. 流動相對柱效測試結(jié)果的影響

流動相中有機相與水相的比例對峰高、 峰面積以及柱效均可能有影響。

案例2:

色譜柱：Waters BEH C18 1.7um 2.1×50mm (PN 186002350 ）測試結(jié)果（流速：0.35ml/min)

產(chǎn)品詳情請點擊：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱 186002350

3. 不同柱效測試液

不同廠家，不同類型的色譜柱其柱效測試的化合物各不相同，如反相色譜柱可選苯、荼、苊等各種類型的檢測方法，盡量采用與廠家相同的化合物測試。

Waters XBridge BEH C18 1.7μm 2.1x50mm 測試不同化合物的結(jié)果：

產(chǎn)品詳情請點擊：Waters XBridge BEH C18色譜柱 186003117

Xterra C18 5.0μm 4.6×250mm測試不同化合物的結(jié)果：

產(chǎn)品詳情請點擊：Waters XTerra MS C18 色譜柱 186000494

4．不同柱內(nèi)徑的影響：

死體積對不同柱內(nèi)徑大小有不同影響 寬內(nèi)徑影響較小，窄內(nèi)徑影響較大。

案例3:

三、正確的柱效測試演示實驗

1.    COA報告

                              圖8

2. 儀器

高效液相色譜儀，需配備合適的檢測器（如紫外－可見檢測器、熒光檢測器等）、進樣器和色譜柱恒溫箱。

注：關注儀器的死體積情況，盡量選擇死體積小的連接管路和檢測器流通池，尤其是在使用小規(guī)格色譜柱時。

四、 操作步驟

若儀器系統(tǒng)之前使用過高鹽體系，建議先用純水沖洗5-10min后， 再接如下步驟操作：

a)    儀器接兩通，待用管路放置新鮮有機相（乙腈或甲醇），灌注5min后先用有機相（乙腈或甲醇）沖洗系統(tǒng)約5min 。

b)    將色譜柱連接至系統(tǒng)上，以0.1ml/min開始緩慢增加流速至0.8 mL/min，小粒徑色譜柱可降低流速。用有機相（乙腈或甲醇）沖洗色譜柱，約20 min。

c)    更換柱效測試流動相， 緩慢調(diào)節(jié)流速至測定流速，平衡色譜柱，一般需5-10倍柱體積，直至壓力和基線穩(wěn)定。 在平衡過程中，密切關注壓力變化，若壓力異常波動，可能存在堵塞或泄漏等問題，需及時排查。

d)    準確吸取適量測試標準品，為保證結(jié)果準確，通常重復進樣3次，記錄下每次測試數(shù)據(jù)。

e)    根據(jù)測得理論塔板數(shù)結(jié)果計算柱效，EP和USP理論塔板數(shù)有區(qū)別。

五、 注意事項

若測試結(jié)果柱效明顯偏低、 峰形拖尾、 柱壓較高，需全面排查問題。

a） 檢查色譜柱是否污染， 可通過沖洗色譜柱或更換保護柱進行驗證。

b） 確認流動相比例是否準確。

c）  檢查儀器系統(tǒng)，包括連接管路是否有泄漏、 堵塞， 檢測器是否正常工作等， 同時考慮死體積是否過大對柱效產(chǎn)生了不良影響。

若對相關內(nèi)容還有任何疑問或者難題，請聯(lián)系Waters授權(quán)代理商——廣州綠百草。